زنگ تفربح 179 ، کروماتوگرافی ، اولین کروماتوگراف ، کروماتوگرافی تبادل یونی ، کروماتوگرافی کاغذی ، کروماتوگرافی گازی ، کروماتوگرافی لایه نازک

---

    کروماتوگرافی روشی برای جداسازی اجزاء تک یک مخلوط است که در نتیجه ی این کار هر جزء شناسایی و آنالیز میشود. در دهه های پس از اختراع کروماتوگراف، این وسیله یکی از بخش های ضروری وسایل آزمایشگاه های بیوشیمی قرار گرفته است. دانشمندان با استفاده از روش تحلیلی کروماتوگرافی می توانند بگویند که کدام یک از ترکیبات شیمیایی در یک مخلوط پیچیده وجود دارند. این مخلوط ها شامل چیزهای مختلفی مانند آلودگی هوا، دود سیگار، محصولات نفتی یا حتی رایحه ی قهوه می شود. بدون کروماتوگرافی شیمیدانان شاید قادر نباشند که پروتیین هایی مانند انسولین را سنتز کنند یا شاید نتوانند بفهمند که گیاهان چگونه از نور خورشید برای تولید غذا استفاده می کنند.

اولین کروماتوگراف :

اولین کروماتوگراف توسط گیاه شناس روسی، میخاییل سمنوویچ تیسوت (Mikhail Semenovich Tsvett) اختراع شد. تیسوت هنگام کار در لهستان به دنبال روشی برای جداسازی مخلوط رنگدانه های گیاهان که از نظر شیمیایی بسیار شبیه به هم هستند بود.

برای مجزا کردن انواع مختلف کلروفیل، او مخلوطی از رنگدانه های محلول را درون یک لوله ی شیشه ای که توسط پودر کلسیم کربنات بسته شده بود ریخت. با شسته شدن محلول و پایین رفتن آن، هر رنگدانه با یک درجه ی استحکام به پودر چسبید که تشکیل یک سری از گروه های رنگی را داد. هر گروه از رنگ ها نشانگر یک ماده متفاوت بود. تیسوت هر گروه رنگی را منسوب کرد به یک کروماتوگرام. او همچنین این روش را ( که اکنون کروماتوگرافی جذب سطحی نامیده میشود) برای جداسازی مواد بی رنگ نیز پیشنهاد کرد.

هر چند تیسوت یک گزارش از کارش در اوایل دهه ی 1900 منتشر کرد اما شیمیدانان اهمیت خیلی کمی به آن دادند. جند دلیل برای عدم مقبولیت کار تیسوت وجود داشت :

اول این مطلب که گزارش به زبان روسی نوشته شده بود که تعداد کمی از شیمیدانان غربی آن را خواندند. دومین دلیل ساده به نظر رسیدن این روش برای دانشمندانی بود که تا آن زمان عادت به فرایند های طولانی استخراج و کریستالیزاسیون یا تقطیر برای جداسازی مخلوط ها کرده بودند. در عرض چند سال روش تیسوت دوباره کشف شد. کشف دوباره ی آن توسط شیمی آلی دان آلمانی، ریچارد مارتین ویلستتر (Richard Martin Willstatter) کسی که او نیز در حال مطالعه  روی کلروفیل بود انجام شد. با معرفی کروماتوگرافی به دانشمندان اروپای غربی، ویلستتر به بنا نهادن یکی از روان ترین روش های آنالیزی در شیمی کمک کرد

کروماتوگرافی تبادل یونی :

کروماتوگرافی به عنوان روشی برای جداسازی انواع مخلوط ها حتی مخلوط های بی رنگ (طبق پیش بینی تیسوت) شناخته شده است . پودرهای آشکار کننده به عنوان مواد موثرتری نسبت به کلسیم کربنات برای جداسازی مولکول های معمول کشف شدند.

همچنین ترکیبی که به نام زئولایت شناخته می شود برای جداسازی یون های تک یا اجزاء دارای بار الکتریکی که همان کروماتوگرافی تبادل یونی است  تولید شد.شیمیدان آمریکایی فرانک هارولد اسپدینگ (Frank Harold Spedding) این روش را برای جداسازی  فلزات خاکی کمیاب (هر یک از عنصرهای کمیاب شیمیایی با عدد اتمی بین 57 تا 71) به کار برد. در دهه ی 1930، رزین های مصنوعی برای کروماتوگرافی تبادل یونی تولید شدند.

کروماتوگرافی کاغذی :

مهیج ترین پیشرفت در تازیخچه ی کروماتوگرافی در سال 1944 روی داد. این زمانی بود که دانشمندان کشف کردند که یک نوار فیلتر کاغذی متخلخل می تواند جانشین ستونی از پودر آشکار ساز شود. این روش کروماتوگرافی کاغذی نامیده شد. در این روش یک قطره از مخلوطی که باید جداسازی شود بر روی کاغذ قرار داده می شود سپس یکی از لبه های کاغذ درون حلال قرار داده می شود. حلال از کاغذ بالا می آید و هر کدام از ترکیبات مخلوط را جذب خود کرده و همراه خودش درون کاغذ به حرکت در می آورد. در طی این عمل ترکیباتی که کمتر جذب حلال می شوند با سرعت کمتری حرکت کرده در نتیجه مسافت کمتری را طی می کنند و ترکیباتی که بیشتر در جذب حلال قرار می گیرند با سرعت بیشتری حرکت می کنند و در نتیجه مسافت بیشتری را طی می کنند که ما فرمول زیر را برای این رفتار در کروماتوگرافی کاغذی داریم :

                                                  فاصله بالا رفتن حلال از مبدا/فاصله بالا رفتن ماده از مبدا = Rf

ما با استفاده از Rf (Rate of flow) و مقایسه ی عدد به دست آمده با مقادیر آمده در جداول مربوطه می توانیم به هویت نمونه ی مجهول پی ببریم. لازم به ذکر است که مبدا می تواند هر نقطه ای باشد اما معمولا بلافاصله بعد از سطح حلال در نظر گرفته می شود.

البته محاسبه ی Rf بعد از خشک کردن نوار کاغذی و نمایان کردن رنگ ها با استفاده از شناساگر انجام می شود. روش مطمئن تر از تشخیص مواد از روی مقدار Rf بریدن قسمتی از کاغذ با رنگ مشخص و آنالیز کر

دن آن با روش های آنالیزی میباشد. این روش یک نوع کروماتوگرافی جزء به جزء محسوب می شود که بیشتر بر اساس تفاوت های ترکیبات در قابلیت انحلال پذیری انجام می شود تا تفاوت های آن ها در جذب سطحی. یکی از فواید استفاده از این روش استفاده ی کم از نمونه در آن است زیرا همانطور که میدانید برخی از مخلوط های شیمیایی بسیار گران قیمت و کمیاب هستند و ما برای شناسایی آن ها نمی توانیم آن ها را هدر دهیم. یکی از مشکلات این روش یا کلا کروماتوگرافی ها این می باشد که ترکیبات مخلوطی که باید جداسازی شود باید حتما دارای میزان قطبیت یا همان انحلال پذیری متفاوت باشند تا در طی کروماتوگرافی از هم جدا شوند.

کروماتوگرافی گازی :

این روش به شیمیدانان اجازه می دهد تا مخلوط های گازی یا موادی که به سادگی تبخیر میشوند و به حالت گازی در میایند را جداسازی کنند. به جای یک حلال مایع معمولا از گاز هلیوم برای فشار دادن مخلوط درون یک ستون و جداسازی ترکیبات گازی استفاده می شود. این روش اولین بار برای میکرو آنالیز اسید های چرب استفاده شد.

استفاده ی گسترده از کروماتوگرافی گازی بیش از همه در رشته های آزمایشگاهی محسوس است. امروزه این روش تقریبا در تمام شاخه های صنایع شیمیایی کاربرد دارد به ویژه در تولید مشتقات نفتی و گازی. یکی از مهمترین وسایل ثابت در آزمایشگاه های بیوشیمی دستگاه آنالیزی GCMS (gas chromatography, mass spectrometry) است. Mass spectrometry به معنای طیف سنجی جرمی میباشد که در آینده در خلال توضیح انواع طیف سنجی ها در مورد این طیف سنجی نیز توضیح داده خواهد شد. دستگاه GCMS ابتدا با استفاده از کروماتوگرافی گازی نمونه را جداسازی می کند و سپس در طی فرایند طیف سنجی جرمی نمونه را از نظر جرمی آنالیز می کند.

کروماتوگرافی لایه نازک :

اخیرا کروماتوگرافی به روش های حرفه ای آنالیزی نیز راه پیدا کرده است. در کروماتوگرافی لایه نازک، برای مثال ژل آلومینا با سیلیکاژن (ژل سیلیکا) یا یک جامد کاملا تجزیه پذیر  بر روی یک صفحه شیشه ای درون یک لایه ی نازک یکنواخت اسپری می شود.

این تجهیزات جای کاغذ فیلتر را در روش کروماتوگرافی کاغذی می گیرد. این روش نه تنها از کروماتوگرافی کاغذی سریع تر است بلکه همچنین می تواند مقادیر کم ترکیبات خالص درون مخلوط را جدا کند. این روش معمولا در صنایع دارویی برای جدا سازی پنی سیلین و دیگر آنتی بیوتیک ها به کار می رود.

حال برای اینکه بتوانید خودتان یک کروماتوگرافی انجام دهید این آزمایش را که به سادگی قابل انجام در خانه است را در اختیار شما قرار می دهم :

انجام کروماتوگرافی کاغذی با استفاده از فیلتر قهوه جوش:

درجه سختی : معمولی

زمان لازم : 2 ساعت

روش انجام کار :

1.  2 یا 3 برگ بزرگ ( یا معادل همان مقدار برگهای کوچک ) را جمع آوری کنید. آن ها را به قطعات کوچک تقسیم کنید و درون شیشه های کوچک درپوش دار قرار دهید.

2. مقدار کافی الکل به اندازه ی پوشاندن برگ ها درون شیشه ها بریزید.

3. شیشه ها را درون یک ماهیتابه ی کم عمق که به اندازه ی یک سانتی متر یا کافی آب داغ شیر دارد بگذارید.

4. بگذارید شیشه ها حداقل به مدت نیم ساعت درون آب داغ باشند. آب داغ را هرگاه که سرد شد تعویض کنید و شیشه ها را هر چند لحظه جابجا کنید. در این مرحله اگر محتوی شیشه ها را هم بزنید در پایان نتیجه ی بهتری خواهید داشت.

5. کار شیشه ها وقتی که الکل درون شیشه ها سبز رنگ شد به پایان رسیده است هر چه رنگ بدست آمده تیره تر باشد، کروماتوگرام واضح تر خواهد بود.

6. برای هر شیشه نوار درازی از کاغذ فیلتر قهوه برش دهید.

7. درون هر شیشه یک نوار کاغذ را قرار دهید، به صورتی که یک سر آن درون الکل و سر دیگر خارج از شیشه باشد. ( توجه داشته باشید که لبه ی نوار حتی اگر در تماس با سطح الکل باشد کفایت میکند )

8. الکل از کاغذ فیلتر بالا رفته که رنگ دانه ها را نیز با خودش یه سمت بالا می برد، در طی این عمل رنگ دانه ها بر اساس وزن و همچنین میزان جاذبه با کاغذ فیلتر از هم جدا میشوند.

9. بعد از 30 الی 90 دقیقه ( یا تا زمانی که جدایی رنگ دانه ها به صورت مناسب و مشخص صورت گیرد ) نوارهای کاغذی در آورده و بگذارید تا خشک شوند.

سوال :

1. آیا تشخیص میدهید کدام رنگ دانه ها در نوارها حاضر هستند؟

2. آیا فصلی که در آن ها برگ ها چیده شده اند روی میزان رنگ ها تاثیر دارد؟

نکات :

1. برگ های اسفناج منجمد خورد شده را امتحان کنید.

2. از انواع کاغذهای دیگر استفاده کنید.

3. می توانید از الکل های دیگر مثل اتیل الکل و متیل الکل استفاده کنید.

4.اگر کروماتوگرام شما کمرنگ بود دفعه ی بعد از برگ های بیشتر استفاده کنید و سعی کنید تا حد ممکن بسیار ریز خوردشان کنید تا رنگ دانه های بیشتری آزاد کنند.

لوازم مورد نیاز : برگ ها ، شیشه ی در پوش دار ، الکل پاک کننده ، فیلتر قهوه ، آب داغ ، ماهیتابه ی کم عمق ، لوازم آشپزخانه.

chromatography.jpg