در اين آزمايش من راه‌حل ساده‌اي براي استخراج DNA از موز شرح مي‌دهم، اگرچه شما حتي مي‌توانيد با ميوه‌ها وسبزيجات ديگر هم اين آزمايش را انجام دهيد.اين آزمايش هم در خانه و هم در آزمايشگاه مدرسه قابل اجرا است.
چگونه از ميوه DNA استخراج كنيم؟
|
در سال‌هاى اخير غير عادى نيست كه درباره‌ي DNA ، مطالبي در مجله‌هاى علمي يا عمومي بخوانيم. DNA) Deoxyribonucleic Acid) كه اين روزها مدام ازآن ياد مي‌كنند مولكول بلندي است كه اطلاعات ژنتيك را درتمام موجودات زنده اعم از گياه، جانور، يا ميكرو‌ارگانيسم‌هاي ساده نگهدارى مي كند.
اين مولكول قادر به كپي كردن خود وسنتز RiboNucleic Acid)RNA) است.در فرم‌هاي پيچيده‌تر حيات، DNA در هسته‌ي سلول قرار دارد. بجز در سلول‌هاي قرمز خون پستانداران كه تهي از هسته است، هر موجود زنده داراى DNA مخصوص به خود است.سلول‌هاى هر ارگانيسم قسمت‌هاي معيني از مولكول DNA يا ژن‌ها را مورد استفاده قرار مي‌دهد تا پروتئين‌هاى مورد نيازعملكرد خود را بسازند.
در اين آزمايش من راه‌حل ساده‌اي براي استخراج DNA از موز شرح مي‌دهم، اگرچه شما حتي مي‌توانيد با ميوه‌ها وسبزيجات ديگر هم اين آزمايش را انجام دهيد.اين آزمايش هم در خانه و هم در آزمايشگاه مدرسه قابل اجرا است.
|
روشى كه در زيرشرح داده خواهد شد بر گرفته از اين حقيقت است كه غشاي خارجي سلول‌ها وغشاي هسته ازتركيبات چربى ساخته شده كه مي تواند بوسيله‌ي يك شوينده‌ي ساده شكسته شود.
در اين روش ابتدا ميوه را بصورت تفاله در آورده بطوري كه سلول از هم جدا مي شود و بدين ترتيب راحت‌تر در مقابل تأثير شوينده قرار مي‌گيرد.
در مرحله دوم شوينده به تفاله ميوه اضافه مي شود تا DNA از غشاي سلول‌ها كه بصورت كپسول آن را احاطه كرده آزاد شود.
در سومين مرحله لازم است كه بوسيله صافي نوكلئيك اسيد را از باقيمانده غشاي سلولي جدا كنيم.
در نهايت DNA در الكل رسوب مي‌كند و قابل مشاهده مي‌شود .
DNA اي كه شما به اين روش به دست مي‌آوريد بوسيله‌ي ميكروسكوپ قابل مشاهده است ومي‌توان براي آزمايش‌هاى ديگر نظير الكتروفورز از آن استفاده كرد.
مواد لازم:
- ديگ كوچك
- دماسنج
- كاسه‌ى پلاستيكي
- تكه‌هاى يخ
cc -50 ايزوپروپيل 95-70% يا الكل تقليبى (اتانول) در يك بطري در بسته
- پارچه كهنه و دستمال كاغذى
روش كار:
يك روز قبل از آزمايش مقداري يخ قالبي آماده كنيد.
حداقل 2 ساعت قبل cc 50 از ايزوپروپيل يا اتانول تقليبي 95-70% رادر يك بطري پلاستيكي در بسته بريزيد وآنرا در فريزر قرار دهيد.(از محكم بودن در بطري مطمئن شويد چرا كه بخار الكل قابل اشتعال است)
15 دقيقه قبل از شروع آزمايش يك ديگ كوچك آب را تا c 60ْ گرم كنيد.
| آماده‌سازي محلول استخراج: |
همانطور كه قبلاً اشاره شد،DNA در داخل هسته‌ى سلول‌هاى ميوه قرار دارد.براي آزاد كردن DNA لازم است كه غشاهاى سلول‌ها وهسته‌هاي آنها تخريب شود.از آنجا كه اين غشاها از فسفوليپيد ساخته شده اند ، كه مولكول‌هايي غني از چربي هستند، ما آنها را بوسيله‌ى يك شوينده‌ى خانگي ساده حل مي‌كنيم. همچنين از كمي نمك خوراكي استفاده مي‌كنيم.اين نمك كمك مي‌كند پروتئين‌هايي به نام هيستون كه DNA روي آنها پيچ خورده حذف شوند.
مواد لازم:
- cc 100 آب مقطر(آب معمولي نيز مي‌توان استفاده كرد)
- ترازو براي اندازه‌گيري وزن (در صورت امكان)
- 3 گرم نمك خوراكي (نصف قاشق چايخوري)
- cc10 شوينده‌ي مايع
-1عدد سرنگ cc 10 بدون سر سرنگ
- يك بشر cc100
- ميله‌ي شيشه‌اي
روش كار:
مقدار 3 گرم نمك وcc 80 آب مقطر را در يك بشر cc 100 بريزيد.آنها را مخلوط كنيد تا نمك كاملا ً حل شود.
به وسيله سرنگ، cc 10 از مايع شوينده برداريد و به محلول اضافه كنيد.
آب مقطر اضافه كنيد تا كل محلول به حجم cc100 برسد.
محلول را طوري مخلوط كنيد كه حباب ايجاد نشود و يك محلول يكنواخت (هموژن) حاصل شود.
محلول استخراج آماده است.
اين عمل براي جدا كردن سلول ها از يكديگر بكار مي رود و براي تأ‌ثيربهتر محلول استخراج روي سلول ها لازم است.
مواد لازم:
- gr 100 موز( يا كيوى، سيب ، گلابي، خرمالو،نخود فرنگي، پياز وغيره)
- ترازو
- چاقو
- تخته آشپزخانه و چنگال
- بشر cc 250
- قاشق چايخوري
روش كار:
100 گرم موز(بدون پوست) را روي تخته‌ي آشپزخانه قرار مي‌دهيم وبوسيله چنگال آن را له مي‌كنيم تا يك خمير يكنواخت به دست آيد.اگر پياز استفاده مي‌كنيد بوسيله چاقو مكعب‌هايي به ضلعmm 5 يا كمتر جدا كنيد. شما مي‌توانيد از هاون يا مخلوط كن هم استفاده كنيد. درصورت استفاده از آنها گوشت ميوه(تفاله) را زياد خرد نكنيد.
تفاله را در بشر cc 250 بريزيد.
هدف از اين عمل تخريب سلول‌ها و هسته‌هاي آنها براي آزاد كردنDNA است.
تفاله (گوشت ميوه) تا c 60ْ گرم مي‌شود تا به روند تخريب سلول‌ها سرعت بخشد.
گرم كردن تفاله همچنين به غير فعال شدن آنزيم‌هاى DNAase كه مقدار DNA را كم مي‌كند، كمك مي‌كند.هر چند اگرتفاله ميوه را به مدت طولاني در دماي بيشتري نگه داريد،DNA شروع به قطعه قطعه شدن مي كند. به همين خاطر توصيه مي‌شود كه تفاله را بعد از 15 دقيقه در يك حمام آب خنك (ظرف پلاستيكي حاوي يخ) قرار دهيد.
مواد لازم:
- دماسنج
- ديگ حاوي آب c 60ْ
- كاسه‌ى پلاستيكي حاوي يخ و آب
روش كار:
محلول استخراج را در تفاله بريزيد.
بشر را در بن ماري (ديگ حاوي آب) c 60ْ قرار دهيد.
تفاله را بهم بزنيد تا محلول استخراج پخش شود و دما يكنواخت گردد.
بعد از 15دقيقه بشر را در بن ماري دارى يخ قرار دهيد. مخلوط را بهم بزنيد تا يكنواخت شود.
بعد از 5 دقيقه بشر را خارج كنيد و خود را براي مرحله بعد آماده كنيد.
:
مرحله صاف كردن براي جمع‌آوري مايع حاوي DNA و جدا كردن آن از باقيمانده‌هاي سلولي وديگر بافت‌هاى ميوه كه دور ريخته مي‌شوند انجام مي‌شود.
مواد لازم:
- الك با قطر حدود cm 12
- كاغذ صافي قهوه (مخصوص دستگاه قهوه‌ساز)- كاغذ صافي آزمايشگاه بسيار ضخيم است- كاغذ‌خشك‌كن آشپزخانه هم مي‌تواند بكار رود، مشروط به اينكه سوراخ قابل ديد نداشته باشد.
- كاسه
روش كار:
الك را روي كاسه قرار دهيد.
يك كاغذ صافي برداريد و آنرا خيس كرده روى الك بگذاريد.
مقداري تفاله برداريد و آنرا روي كاغذ صافي بگذاريد. مراقب باشيد تا تمام مواد ازبين كاغذ صافي عبور كند.
آنرا به آرامي بهم بزنيد تا به روند صاف كردن كمك كند و مراقب باشيد تا كاغذ صافي كنار نرود.
مايعي كه بدست خواهيد آورد حاوي DNA است.
| جدا كردن پروتئين: (اختياري) |
بوسيله اين عملياتِ اضافه، شما مي‌توانيد يك عصاره‌ي خالص DNA داشته باشيد ولي براي ديدن
DNA ضروري نيست. به خاطر اينكه DNA به دور پروتئين‌هايي به نام هيستون پيچيده شده، براي به دست آوردن DNA خالص بايد اين پروتئين‌ها را جدا كنيد. براي جدا كردن هيستون ها شما مي‌توانيد از آنزيم‌هاي پروتئوليتيك مانند پروتئاز استفاده كنيد. شما مي‌توانيد آنزيم پروتئاز را از مغازه‌اي كه مواد شيميايي و آزمايشگاهي مي‌فروشد، تهيه كنيد يا مي‌توانيد آن را به وسيله ماده ديگري جايگزين كنيد كه بسيار راحت‌تر پيدا مي شود، اين ماده در آب آناناس پيدا مي‌شود كه حاوي بروملائين است. ماده‌اي كه مي‌تواند پروتئين‌ها را به آمينو اسيدهاي سازنده‌شان تجزيه كند.
مواد لازم:
- آنزيم پروتئوليتيك (مثل پروتئاز يا آب آناناس- آب آناناس را از ميوه‌ي آناناس تهيه كنيد)
- يك سرنگ cc 5 بدون سر سرنگ
روش كار:
در يك لوله آزمايش cc 5 از مايع شوينده بريزيد.
cc 1آب آناناس بريزيد ومخلوط كنيد.
3-2 دقيقه صبر كنيد تا پروملائين اثر خود را بگذارد.
DNA مقداري در آب محلول و غير قابل ديدن است. در حالي كه در الكل نا‌محلول است و در آن رسوب كرده و قابل ديدن مي شود. با اضافه كردن الكل به محلول، صاف شده‌ي DNA در لوله آزمايش DNA ظاهر مي شود.
مواد لازم:
- تعدادي لوله آزمايش براي تكرار آزمايش
- گيره
- الكل سرد (الكلي كه مدتي در فريزر بوده است)
روش كار:
- به آرامي! مقداري از الكل سرد را داخل لوله آزمايش مرحله‌ي قبل مي‌ريزيم به‌طوري‌كه با محلول صاف شده مخلوط نشود.
- حجم الكل بايد با حجم محلول برابر باشد.
- بگذاريد لوله آزمايش 5 دقيقه ساكن بماند تا DNA رسوب كرده و در لوله جمع شود.
اكنون در نقطه‌ي تماس الكل و محلول صاف شده شما قادر به ديدن ماده‌اي شيري رنگ هستيد كه با گذشت زمان به حجم آن اضافه مي‌گردد. اين ماده‌ي شيري DNA موز است. متاسفانه در اين توده‌ي شيري كوچك شما تعداد زيادي حباب كوچك مشاهده مي‌كنيد. وجود اين حباب‌ها به اين دليل است كه حل‌پذيري گازها در مايعات سرد بيشتر از مايعات گرم است. هنگامي كه الكل در فريزر است مقداري گاز را جذب مي‌كند كه با گرم شدن مايع اين گازها آزاد مي‌شوند.
| مشاهده با میکروسکوپ(اختیاری) |
مواد لازم:
- لام تميز ميكروسكوپ
- يك قلاب كه بوسيله مفتول فلزي ساخته شده
- رنگ براى رنگ‌آميزي هسته (تولوئيدن، متيلن بلو، استواورسئين)
- قطره چكان
- ميكروسكوپ
روش كار:
بوسيله يك مفتول فلزي قلاب‌دار مقداري از DNA را از داخل لوله آزمايش خارج كنيد و آنرا روى لام تميز قرار دهيد.توده‌ى را روى لام با رنگ هسته رنگ‌آميزي كنيد.اگر لازم است يك قطره كوچك آب اضافه كنيد و لامل را روي آن قرار دهيد.با مشاهده آن زير ميكروسكوپ انتظار نداشته باشيد كه نردبان دوبل-هليكس DNA را ببينيد. شما حتي به كمك ميكروسكوپ الكتروني هم نمي‌توانيد آن را ببينيد. چيزي كه خواهيد ديد انبوهي از توده‌ى DNA است كه شبيه رشته‌هاى به هم پيچيده‌ى پروتئين است.
انجام آزمايش آن قدر هم سخت نبود.بود؟
هدف از اين آزمايش ساده، آماده كردن شما براي آشنايي با روش‌هايي است كه در زيست‌شناسي مولكولي به كار مي‌رود. اغلب تكنيك‌هاي مورد استفاده در آزمايش‌هاي ميكروبيولوژي مدرن ساختار ساده‌اى شبيه اين دارند. در مواردي هم پروسه تا حدودي پيچيده‌تر مي‌شود و نياز به تجهيزات بيشتري دارد.در همه‌ي اين موارد داشتن دانش ضمني درباره‌ى زيست وشيمي ضرورى است. اين آزمايش براي علاقمند كردن شما براي كشف‌هاى آينده است.
مطالب مفید برای مطالعه در این زمینه:
آموزش گام به گام استخراج دی ان ای
ساختمان دی ان ای
آزمایش پاپ اسمیر